摘要：以中国野生葡萄刺葡萄、毛葡萄、华东葡萄和欧洲葡萄的10个株系和品种果实为试材，在田间抗病性鉴定基础上，通过解剖观察不同葡萄果实表皮组织结构特点和差异，探究葡萄果实表皮组织结构与抗白粉病的关系。结果表明，刺葡萄‘塘尾’‘福建-4’，毛葡萄‘丹凤-2’‘泰山-12’‘商-24’为抗病种质，华东葡萄‘白河35-1’‘湖南-1’;欧洲葡萄‘无核白’‘红地球’‘佳丽酿’为敏感品种。刺葡萄、毛葡萄、华东葡萄的表皮角质层比欧洲葡萄‘无核白’厚，刺葡萄和毛葡萄表皮层细胞排列规则且紧密，而欧洲葡萄‘无核白’表皮角质层最薄，表皮层细胞排列不规则且松散。刺葡萄‘塘尾’表皮层和亚表皮层细胞最厚，毛葡萄‘丹凤-2’和华东葡萄‘白河35-1’次之，欧洲葡萄品种‘无核白’的表皮层和亚表皮层最薄。相关性分析表明，葡萄果皮角质层厚度、表皮层厚度与对白粉病的抗性显著正相关，抗病种质的果皮角质层与表皮层厚度普遍厚于感病种质。
据联合国FAO统计数据显示(FAO，)，年全球葡萄产量达.7万t，中国葡萄产量.5万t，居世界首位。全球葡萄生产中大多是高产优质的欧亚种葡萄，其鲜食爽口却易受病害威胁，尤其是白粉病的威胁(Wangetal.，;王跃进和贺普超，)。
中国作为葡萄属(Vitis)植物的重要起源中心之一，拥有丰富的野生葡萄种质资源，对真菌病害表现出极好的抗性(Wangetal.，;贺普超，;)。本课题组前期以华东葡萄‘白河35-1’和毛葡萄‘丹凤-2’的叶片对葡萄白粉病进行了相关研究，鉴定到许多抗病基因，包括泛素连接酶基因UIRP1(余义和，)、VqDUF(XieWang，)、VpPUB24(Yaoetal.，)、芪合成酶基因VqSTS12、VqSTS25(吴凤颖等，)等。贺普超等()证实了中国葡萄属植物中一些种和株系对多种真菌病害表现出很强的抗性，所有的野生种葡萄果实对黑痘病、白腐病和炭疽病似乎都是免疫的。植物采用多种方式抵御病原菌的侵入，其中包括利用自身固有的结构，如角质层与表皮蜡、气孔等(Dominguezetal.，;YeatsRose，;Isabeletal.，)。普遍认为角质层和表皮的薄厚，与果实抗病性、耐贮性密切相关(BargelNeinhuis，;Hetzronietal.，;Oliveiraetal.，)。在果实结构与抗病性方面，在番茄(于萌萌等,)、枣(田昕，)、杧果(常金梅等，;Bally，)、苹果(关晔晴，)等上都有一定研究，而中国野生种葡萄果皮结构与抗性的研究较少。
本研究在田间自然抗病性鉴定与人工接种白粉病菌鉴定中国野生葡萄种质资源的基础上，以欧洲葡萄为对照，通过对中国野生刺葡萄、毛葡萄、华东葡萄果皮组织的解剖结构观察，比较果皮组织结构差异，研究其与果实抗性的关系，从结构方面比较不同株系葡萄果实的抗病性，为利用中国野生葡萄果实组织结构抗病特性，为欧洲葡萄品种杂交育种，改良欧洲葡萄品种的抗病性提供抗病种质资源与理论依据。
一、材料与方法
1.1试验材料
年6—9月在西北农林科技大学野生葡萄资源圃选择树势生长均衡、管理水平一致的10个材料(欧洲葡萄(V.vinifera)品种‘无核白’、‘红地球’、‘佳丽酿’;中国野生葡萄华东葡萄(V.pseudoreticulata)株系‘白河35-1’和‘湖南-1’，毛葡萄(V.quinquangularis)株系‘丹凤-2’、‘商-24’和‘泰山-12’，刺葡萄(V.davidiiFox)株系‘福建-4’和‘塘尾’进行其对白粉病的抗性鉴定。绿果期(6月10日—7月5日)、转色期(7月15号—8月16日)、成熟期(8月1日—9月20日)采集无病虫害与机械损伤的果穗5穗，每穗选取完好果实2粒进行表皮蜡质测定和组织解剖结构观察。
1.2葡萄果实白粉病的田间抗病性鉴定
田间自然抗病性鉴定是在田间自然发病严重情况下，参照发病分级(王跃进等，)调查田间果实的抗病性。随机选取5~10个果穗，按照发病果粒占整个果穗粒数的百分比分为0~7级:0级无感病果;1级0~5%感病;2级5.1%~15%感病;3级15.1%~30%感病;4级30.1%~45%感病;5级45.1%~65%感病;6级65.1%~85%感病;7级85%感病(图1)。每个株系3次重复。根据发病率计算病情指数Σ(病级值×该级发病果实数)/(调查总果实数×最高病级值)×，按照病情指数分为不感病、高抗、抗病、感病、高感5个等级。
田间人工接种鉴定参照王跃进等()的方法，花后30d在田间对葡萄果实进行喷雾接种，接种浓度2×10^5个·mL-1白粉菌孢子，即时套上硫酸纸袋，在接种1周后调查果实发病情况，统计发病百分率，进行抗性反应分级。
1.3蜡质量测定
参照Yang等，()的方法，随机选取5个果粒置于蒸发皿中，用氯仿完全浸没，30s后用镊子取出，氯仿挥发后可明显看到白色物质，测定其质量(μg)，即葡萄果实表皮总蜡。用游标卡尺测定果实的纵、横径，果实表面积(mm2)=4πr2。单位面积蜡质含量(μg·mm-2)=总蜡质量/总表面积。3次重复。
1.4果实表皮组织解剖结构观察测定
显微结构观察:从果实中部垂直果皮切取0.5cm×0.5cm×0.5cm方块，用FAA(70%酒精90mL+冰醋酸5mL+38%甲醛5mL)固定。垂直果皮方向切片，切片厚度8~12μm，番红-固绿染色，中性树胶封片。每个材料制作10张显微玻片，于光学显微镜下观察、拍照。利用ImageJ软件测量果皮角质层、表皮细胞、亚表皮细胞厚度。
超微结构观察:采回果实冲洗干净，在果实中部垂直果皮切取0.7cm×0.7cm×0.3cm方块用4%戊二醛固定，乙醇梯度(30%、50%、70%、80%、90%、%)脱水，乙酸异戊脂置换(Silvaetal.，)，二氧化碳临界点干燥法对材料进行干燥后，粘于金属台上喷铂金处理，在S-冷场发射扫描电子显微镜下观察拍照。
采用Excel软件进行数据处理，结果以平均值±标准差表示。采用ANOVA单因素方差分析后进行LSD检验，SigmaPlot软件作图。
二、结果与分析
2.1不同葡萄种质果实田间抗病性表现
田间自然发病调查表明，野生葡萄华东葡萄、毛葡萄和刺葡萄中，除‘湖南-1’外，其余均对白粉病表现为抗病(表1)。刺葡萄未观察到感白粉病的果实，对白粉病表现为不感病;毛葡萄整体表现为抗病，抗性程度在种内存在差异，‘丹凤-2’在3个株系中病情指数最低，仅为2.30%，表现为高抗，‘商-24’同样为高抗，‘泰山-12’病情指数5.35%，划分为抗病类型;华东葡萄种内差异较大，‘白河35-1’为抗病类型，但‘湖南-1’病情指数高于一些欧洲葡萄，划分为高感病型。欧洲葡萄‘红地球’、‘无核白’病情指数27.24%、56.09%，划分为感病类型;‘佳丽酿’为抗病。
田间人工接种鉴定1周后所有欧洲葡萄包括‘佳丽酿’在内均表现为感病，其中‘无核白’高感;野生葡萄中，在自然情况分别表现感病和抗病的‘湖南-1’和‘白河35-1’发病率提高，表现为感病，其余仍表现为抗病，在抗性程度上有所差异。刺葡萄仅观察到数粒感病果实，病斑面积极小，抗性表现为高抗;毛葡萄发病率小幅度提高，由2.30%~5.35%提高至5.30%~6.35%，均为抗病类型(表1)。
结合田间自然条件及人工接种鉴定结果，中国野生刺葡萄‘塘尾’、‘福建-4’抗性反应为1~2级，划分为白粉病高抗类型，毛葡萄‘丹凤-2’、‘商-24’、‘泰山-12’为3级抗病，欧洲葡萄‘红地球’、‘佳丽酿’和华东葡萄‘白河35-1’抗性反应4级，划分为感病类型，欧洲葡萄‘无核白’和华东葡萄‘湖南-1’为高感类型(表1)。
2.2果实不同发育时期果实表皮蜡质量测定
由图2可知，各材料在绿果膨大期果表皮蜡质量均达到峰值，且种间差异显著，毛葡萄、刺葡萄果实表面蜡质量较高，其中毛葡萄‘泰山-12’最高，为.16μg·mm^-2,‘商-24’次之，‘丹-2’种内最低;‘湖南-1’比欧洲葡萄‘无核白’和‘佳丽酿’低;‘红地球’最低，仅15.6μg·mm^-2。随着果实发育，果实表面蜡质呈梯度式大幅度减少，成熟期各材料的为绿果期的1%~10%;种间差异缩小。
2.3葡萄果实表皮的组织解剖与显微结构
2.3.1角质层厚度
由图3可观察到，所有供试种质果实在绿果期已具有完整的角质层，随着果实发育，欧洲葡萄‘无核白’果实表皮角质层没有出现明显变化，转色期角质层厚度达到最大值，而‘红地球’、‘佳丽酿’和野生葡萄随着果实转色成熟，角质层不同幅度增厚(表2)。果皮角质层的厚度和细胞形状存在种间差异。各种质角质层厚度在绿果期为56~10.47μm，其中表现为抗病型的刺葡萄、毛葡萄的不同株系果皮角质层比感病型的欧洲葡萄果皮角质层厚，细胞形状规则，排列更紧密，在角质层细胞表面可观察到明显的透明蜡质。蜡层厚度在种间不同株系存在差异。欧洲葡萄仅‘佳丽酿’表皮覆盖蜡层，其厚度接近野生葡萄，但细胞排列较松散。华东葡萄‘白河35-1’、‘湖南-1’的角质层较厚，在绿果期与刺葡萄、毛葡萄差异不大，但随着果实发育，角质层增长缓慢，厚度远小于刺葡萄和毛葡萄，且角质层表面存在凸起，出现表皮断裂，不连续。欧洲葡萄‘无核白’、‘红地球’果皮同样存在角质层断裂，无明显的蜡质层覆盖。
2.3.2表皮层组织结构
葡萄果皮是多层细胞结构，一般为2~3层，细胞呈扁平状，且排列整齐而紧密，由外向内逐层增大，随着果实的成熟发育，表皮细胞层数没有发生变化，但细胞体积不同程度增大。不同时期组织解剖结构不同(表3)。刺葡萄的表皮细胞厚度远大于其他葡萄种质，毛葡萄次之，两种葡萄果实的表皮细胞形状都较规则;排列致密，与角质层细胞、亚表皮细胞结合紧密。华东葡萄表皮虽然较厚，但细胞排列较松散，与亚表皮细胞结合不紧密。欧洲葡萄表皮细胞层相对较薄，形状不规则且排列松散，与亚表皮细胞结合不紧密。
2.3.3亚表皮结构
亚表皮是表皮与果肉的过渡层，细胞体积较表皮细胞大，细胞层数因品种不同多为3~12，远大于表皮细胞层数。亚表皮细胞与葡萄果实发育一致，在绿果期快速分裂到一定数量，进入转色成熟期细胞体积快速膨大，亚表皮厚度达到最大值(表4)。4个种的葡萄亚表皮厚度存在显著差异。刺葡萄的亚表皮厚度最大，细胞层数最多，为9~12层;毛葡萄次之，7~9层。这两种葡萄亚表皮细胞形状规则且排列致密，与表皮、果肉细胞结合紧密。与刺葡萄和毛葡萄相比，华东葡萄亚表皮层较薄，‘白河35-1’与‘湖南-1’细胞层数相似，有6~8层，细胞排列较松散，与果肉细胞结合不紧密。欧洲葡萄‘佳丽酿’果皮较厚，亚表皮厚度达到μm以上，细胞排列较紧密，而无核白亚表皮厚度最薄，细胞层数最少，仅3层，细胞不规则，排列疏松(图3)。
2.4葡萄果实表皮层组织解剖结构与抗病性的关系
对上述田间自然鉴定病情指数与果实表皮蜡多少、显微结构等指标进行相关性分析，结果(表5)表明，病情指数与不同时期的角质层厚度、表皮细胞厚度、亚表皮细胞厚度、表皮蜡呈负相关，其中绿果期病情指数与角质层厚度(-0.*)及表皮厚度(-0.*)呈显著负相关，转色期病情指数与角质层、表皮及亚表皮厚度呈显著负相关，成熟期病情指数与蜡质、角质层、表皮及亚表皮厚度呈显著负相关，而果实的抗病性随着发育成熟而下降，所以，葡萄果实对白粉菌的抗性与果皮角质层厚度、表皮细胞厚度有一定的正相关性。
2.5葡萄种质果实表皮层超微结构与差异
扫描电镜观察，所有葡萄果皮外层都覆盖着不同数量的蜡质。欧洲葡萄‘无核白’和‘红地球’表皮层以片状结构连接，表面凹凸起伏，片层之间存在大量空隙(图4，a-1、a-2)，因而对病原菌的侵入敏感，当孢子附着在表皮时，附着胞产生菌丝从片层空隙侵入(图4，b-1、b-2)，表皮层破裂。‘佳丽酿’表皮层较厚，片状结构连接紧密，表面凹凸起伏明显，但存在大量蜡质堆积，片层间空隙较‘无核白’与‘红地球’少。华东葡萄表层细胞相对平整，有轻微凹凸起伏，表皮角质分布不均，存在一些角质堆积形成的“嵴”，表皮角质较薄，存在一些微小裂隙(图4，a-5)，是易被病原菌侵染的薄弱位点。毛葡萄的表皮层较厚，‘丹凤-2’表面可看到蜡质堆积形成的梯田状网格线，‘泰山-12’表面存在多层结构堆积，有明显白色蜡质，表皮层十分致密，能够较好地抵抗病原菌孢子侵入时产生的机械压力，阻止菌丝刺穿表皮细胞，表现出较好的抗病性。刺葡萄表面蜡质层分布十分均匀，蜡质以细小的颗粒状存在，表皮层结构致密，无明显的凹凸起伏，角质堆积平整光滑，当病原菌附着在表皮细胞时，紧密的角质层增加了孢子穿透表皮细胞所需物理力量，阻碍菌丝侵入，同时较厚的角质层保护表皮破裂，发挥物理屏障的作用(图4，a-10)，所以在田间表现为不感白粉病。
三、讨论
植物表皮组织作为“第一道防线”发挥物理屏障作用，保护植物免受病害、生物与非生物胁迫(Scottetal.，;Heredia-Guerreroetal.，)。在病原菌侵入时，植物表面蜡质形成的疏水层避免部分病原菌的附着和侵入(Dominguez，;YeatsRose，;Lewandowskaetal.，;Sharmaetal.，;)。Hansjakob等()证明角质层在病原菌附着胞形成中起着重要作用，厚实的角质层能阻碍真菌穿透，表现较强的抗病性。
果实角质层厚、表皮细胞排列紧密和果皮较厚的园艺植物品种，能够更好地保持果实完整性，抵御病原菌的侵入和机械损伤(Dominguezetal.，;Konarska，)。Lafuente等()报道，‘Navelate’柑橘经乙烯处理后对指状青霉(Peniciliumdigitatum)引起的病害抗性增强，这归因于处理果实中新蜡质的合成，这些蜡质可能覆盖在气孔裂缝或蜡层薄的区域，形成物理屏障。Aarrouf等()发现，桃果实在受到树生黄单胞菌(Xanthomonasarboricolapv.Pruni)侵染时，侵染点细胞壁加厚。番茄在受到灰霉菌(Botrytis.cinerea)侵染时，果实组织坏死区域边缘处的细胞壁出现木栓质沉淀，阻止病原菌的侵染(deLeeuw，)。病原菌侵染果实细胞时试图穿透细胞壁某一位置，往往引起该位点细胞壁沉积物堆积形成乳突，这是细胞壁木质化的结果(Bechingeretal.，;袁树枝等，)。Suzuki等()发现，日本梨在接种黑斑病菌(Alternariaalternata)9h后，抗病植株乳突数显著大于感病植株;本试验中也在毛葡萄果皮观察到较多乳突。
关于葡萄组织结构与抗病性关系的早期研究中，Marois()认为角质层厚度和蜡质数量与葡萄对灰霉病菌的抗性呈正相关;Gabler等()证实了表皮和皮下细胞层厚度、角质层和蜡质含量与葡萄灰霉病抗性呈正相关;Commenil等()认为角质层中的角质含量和角质层厚度是‘黑比诺’葡萄对灰霉病菌易感的敏感性指标。4个无核葡萄品种在浸泡热乙醇后，更易受到病原菌侵染(Gableretal.，)。表皮角质层上的蜡质完整性与抗病性密切相关。许多研究表明，果实表皮微裂缝、皮孔及机械伤口是真菌理想的侵入位点(Isabeletal.，;关晔晴，)。高海燕等()认为葡萄表皮上的角质层蜡质具有阻止病虫害侵入的作用，可减少外界不良因素对果实的影响，氯仿去除‘无核白’表皮蜡质后，发现灰霉病菌感病率显著增加(Maroisetal.，)。周会玲和李嘉瑞()对4种葡萄进行解剖结构比较，认为角质层薄且形状不规则，表皮蜡层之间空隙大的品种，病原物易穿透表皮的屏障组织侵入。
对中国野生葡萄组织结构抗病的研究认为，葡萄野生种的果皮细胞和果皮角质层厚度与其抗白腐病和炭疽病呈正相关(贺普超等，)。角质层较厚、表皮蜡质致密、表皮细胞较厚时，果实不易受到病原菌侵染，本研究结果与之一致，表现抗病的中国野生葡萄角质层、表皮细胞厚度明显厚于易感病欧洲葡萄品种，且细胞形状规则排列紧密，与亚表皮层结合紧密，且发病率与角质层厚度、表皮厚度呈显著负相关，解剖组织结构观察也表明野生葡萄的表皮细胞壁增厚形成的乳突数明显多于易感病品种。进一步扫描电镜观察到病害易感品种表皮明显附着孢子且菌丝通过果面微裂缝刺穿表皮进入果实内部，而抗病品种表皮很少出现微裂缝。当病原菌侵入果实，果皮是第一道屏障，中国野生葡萄果皮较厚，角质层细胞排列致密，表皮层也较厚，表现出抗病的特性，不同种质果实对病原菌侵染的抗性差异与果实细胞壁抗性反应不同有关。植物组织表皮层的形成受植物基因调控，Xie和Wang()认为细胞壁蛋白VqDUF6参与植物生长发育和对病原菌的抗性，过表达VqDUF64后葡萄对白粉病抗性提高。下一步将针对中国野生葡萄组织结构抗病特性，结合田间抗病性、果实表皮组织解剖显微结构与细胞壁形成基因的关系进行研究，以期揭示控制表皮层形成的组织结构抗病性与细胞壁形成基因的功能，完善中国野生葡萄组织结构抗病基因作用机理。
经田间自然鉴定与人工接种诱发鉴定，5个中国野生葡萄种质(刺葡萄‘塘尾’与‘福建-4’，毛葡萄‘丹凤-2’、‘泰山-12’与‘商-24’)抗病。中国野生葡萄果实表皮较厚的角质层、表皮层以及表皮细胞壁增厚形成的乳突是其抗白粉病的组织结构屏障与组织结构抗病性特性。因此，选择农艺性状与结实较好的中国野生葡萄种的株系与欧洲葡萄品种进行杂交育种，是创造抗病新种质与改良欧洲葡萄品种抗病性的有效措施与途径。
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