我校中药研究所在NatureCommu [复制链接]

木脂素是一类由两分子苯丙素单元氧化聚合而成的植物次生代谢产物，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化和保肝等多种生物活性，其丰富的生物活性与结构多样性密切相关。松脂素-落叶松脂素还原酶（Pinoresinol–lariciresinolreductases，PLR）是木脂素生物合成的关键酶，能催化松脂醇（Pinoresinol，Pin）生成落叶松脂素（Lariciresinol，Lar），并能进一步催化落叶松脂素生成开环异落叶松脂素（Secoisolariciresinol，Sec）。PLR的底物选择性直接决定了下游木脂素的结构骨架，是导致木脂素类化合物结构多样性的关键节点。

年5月14日，我校中药研究所中药资源与生物技术中心、中科院分子植物科学卓越创新中心、海军军医大学和江南大学研究团队合作在NatureCommunications杂志在线发表了题为“Structure-basedengineeringofsubstratespecificityforpinoresinol-lariciresinolreductases”的研究成果，阐明了PLR底物选择性的结构基础。

研究团队以三个底物选择性差异的PLR为研究对象对PLR的催化机制和底物选择性开展研究。来自菘蓝的IiPLR1能高效催化两步反应，而来自拟南芥的AtPrR1和AtPrR2对第一步反应有较高的选择性，其中AtPrR1催化第一步反应的效率显著强于第二步反应；AtPrR2对第二步反应完全没有催化作用（图1）。

科研人员首先解析了IiPLR1/AtPrR1/AtPrR2处于apo、NADP+结合以及底物或产物结合的晶体结构。基于结构的分析发现，PLR/PrR蛋白包含N端的NADPH结合结构域（NBD）和C端的底物结合结构域（SBD），并且均以首尾相连的二聚体形式存在。b4loop起到门控开关的作用，其摆动可以控制NADPH的进出。在底物共晶的结构中，底物深深插入结合口袋并被牢牢固定，这种结合使得底物处于特定的朝向并且NADPH能够接近并还原呋喃环。结合结构和突变体实验分析，研究人员发现底物结合口袋由两个单体共同构成，Mol-B分子直接参与底物结合（46位氨基酸）并影响了催化活性（图2）。

通过进一步比较IiPLR1/AtPrR1/AtPrR2与底物共晶的结构（图3），发现b4loop在IiPLR1中是无序的，而在AtPrR1/AtPrR2中b4loop翻折并盖向了底物结合口袋。序列比对发现loop基部氨基酸（98位）的差异可能导致了结合NADPH后整个b4loop翻转能力的差异，进而影响了底物结合和催化活性。

对影响b4loop摆动的关键氨基酸进行定点突变，发现突变体IiPLR1_S98A、IiPLR1_S98H和IiPLR1_S98N均能有效降低IiPLR1催化Lar生成Sec的转化率；而对AtPrR1和AtPrR2分别进行反向定点突变，发现催化Lar生成Sec的转化率均有不同程度的提高，有趣的是突变体AtPrR2_N98S使得AtPrR2获得了催化Lar生成Sec的能力（图4）。这些结果表明b4loop在控制底物催化特异性上发挥着重要作用。

将IiPLR1及其突变体导入大肠杆菌中，并与生产Pin的大肠杆菌底盘细胞进行共培养，发现与体外酶活的结果相似，与IiPLR1相比，突变体生产Sec的效率显著降低，其中IiPLR1_V46A生产Lar的产量最高，达到.79mg/L（图5）。这项研究阐明了PLR/PrR催化底物反应的机制，并深入揭示了PLR/PrR底物特异性识别的机制，同时为以PLR为基础的木脂素类成分高效定向生产指明了方向。

上海中医药大学中药研究所中药资源与生物技术中心肖莹副研究员、中科院分子植物科学卓越创新中心邵凯博士、江南大学周景文教授为本文的共同第一作者。上海中医药大学中药研究所中药资源与生物技术中心、海军医院陈万生教授及中科院分子植物科学卓越创新中心张鹏研究员、海军军医大学药学院张磊教授为本文的共同通讯作者。该研究得到了国家科技部重点研发计划（YFC，YFA，YFC，SQYFA）、国家自然科学基金项目（，，，，，）、上海市科委中央引导地方项目（YDZX48）等的资助。